ใน ขั้น ตอน Annealing ของปฏิกิริยา PCR เกิด เหตุการณ์ ใด ขึ้นในหลอดทดลอง

เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เป็นเครื่องมือวิทยาศาสตร์ที่มีในห้องปฏิบัติการที่ทำงานเกี่ยวข้องกับ DNA โดยเป็นเครื่องมือที่ใช้ประกอบกับเทคนิค PCR ในการเพิ่มปริมาณ DNA ขึ้นในหลอดทดลอง การรู้ถึงหลักการของเครื่องมือ วิธีการใช้งานอย่างถูกต้อง จะทำให้ผลการทดลองหรืองานวิจัยนั้นมีความน่าเชื่อถือ

เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เป็นเครื่องมือวิทยาศาสตร์ที่มีในห้องปฏิบัติการที่ทำงานเกี่ยวข้องกับ DNA ลักษณะของเครื่องเหมือนหม้อหุงข้าว เมื่อเปิดฝาออกภายในมีหลุมสำหรับใส่ตัวอย่าง ขนาด 0.2 ml จำนวน 48-96 หลุม (ตามคุณสมบัติของแต่ละเครื่อง) เครื่องนี้มีความสามารถในการปรับเปลี่ยนอุณหภูมิร้อนและเย็น และในแต่ละช่วงอุณหภูมินั้นสามารถตั้งเวลาได้ การทำงานจะเปลี่ยนอุณหภูมิ ระยะเวลา ตามโปรแกรมที่ตั้งไว้ หมุนเวียนกันไปนับเป็นจำนวนรอบ โดยในช่วงอุณหภูมิและระยะเวลาที่แตกต่างกันจะส่งผลต่อตัวอย่าง DNA ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงขึ้นในหลายลักษณะ เทคนิคที่ใช้ในการเพิ่มปริมาณ DNA ขึ้นในหลอดทดลอง เรียกว่าเทคนิคพีซีอาร์ หรือ polymerase chain reaction เทคนิคนี้จะเพิ่มปริมาณ DNA ขึ้นโดยอาศัยหลักการการจำลองตัวเอง ในธรรมชาติ DNA จะอยู่เป็นสายคู่บิดเกลียววนขวา ประกอบด้วยเบส A T C และ G การเพิ่มปริมาณ DNA ในหลอดทดลองจะมี 3 ขั้นตอนคือ

1)      Denaturation เป็นการแยกสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจากสภาพที่เป็นเส้นคู่ให้เป็นเส้นเดี่ยวโดยใช้อุณหภูมิในช่วง 92-95 องศาเซลเซียส

2)      Annealing เป็นขั้นตอนที่ลดอุณหภูมิลงอยู่ในช่วง 50-60 องศาเซลเซียส และใช้ไพรเมอร์ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายสั้น ๆ (ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์จำนวน 17-24 เบส) ที่มีลำดับเบสเป็นเข้าคู่กับสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจับคู่กัน

3)      Extension เป็นขั้นตอนการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่โดยสังเคราะห์ต่อจากส่วนปลายของไพรเมอร์ (ที่ใส่เข้าไปในขั้นที่สอง) ตามข้อมูลบนดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบแต่ละสายโดยอาศัยการทำงานของเอ็นไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ซึ่งเอนไซม์นี้ทำงานได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิ 72-75 องศาเซลเซียส

การทำ PCR ขั้นตอนที่ 1 ถึง 3 นับเป็นจำนวน 1 รอบ ให้ผลผลิตเป็นดีเอ็นเอสายคู่ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สมกับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบ เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า และเมื่อทำ PCR ขั้นตอนที่ 1 ถึง 3 หมุนเวียนไปอีกหลาย ๆ รอบ ปริมาณดีเอ็นเอจะเพิ่มขึ้นได้หลายเท่าทวีคูณ กล่าวคือปริมาณ DNA จะเพิ่มตามจำนวนรอบในการทำ PCR โดยปริมาณ DNA จะเท่า 2n เมื่อ n เท่ากับจำนวนรอบ

เทคนิค PCR นี้สามารนำไปใช้ประโยชน์ในการวิจัยด้านต่างๆ เช่นทางการแพทย์ ใช้ในการวินิจฉัยโรคต่าง ๆ ทั้งโรคติดเชื้อและโรคจากพันธุกรรม ได้แก่ การตรวจหาเชื้อไวรัสหรือแบคทีเรียที่เป็นสาเหตุของโรค ทำให้การวินิจฉัยโรคเพื่อป้องกันและรักษาเป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพมากยิ่งขึ้น ทางการเกษตร มีประโยชน์ต่อการตรวจวินิจฉัยโรคพืช การตรวจสอบสายพันธุ์พืช นอกจากนี้แล้วเทคนิคพีซีอาร์ ยังช่วยให้เข้าใจพันธุกรรมของเชื้อโรคพืช ตลอดจนการนำไปใช้ในการป้องกันกำจัดโรคพืชที่เกิดจากเชื้อรา แบคทีเรีย และไวรัส หรือเชื้อสาเหตุโรคอื่น ๆ

นางสาวนันทยา  อัครอารีย์ 

            โดยปกติแล้วสิ่งมีชีวิตมีการสังเคราะห์ DNA (DNA Replication) ขึ้นใหม่ในระหว่างที่มีการ แบ่งเซลล์โดย DNA จะแยกออกจากกันเป็นสองสายคล้ายกับการรูดซิบ และพอลินิวคลีโอไทด์แต่ละสายจะ ทำหน้าที่เป็นแม่พิมพ์ในการสร้าง DNA สายใหม่ ทำให้ได้ DNA สายใหม่ที่เหมือนกับ DNA โมเลกุลเดิม ทุกประการ

      แล้วเราจะสามารถสร้าง DNA ขึ้นมาเองบ้างได้หรือไม่ ?

        เราสามารถสร้าง DNA ขึ้นเองได้ภายในหลอดทดลอง (in vitro) โดยไม่ต้องอาศัยเซลล์ของ สิ่งมีชีวิต ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอชัน หรือพีซีอาร์ (Polymerase Chain Reaction, PCR) ซึ่งเป็นเทคนิค ที่ ใช้ในการเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนของ DNA โดยมีการทำปฏิกิริยาอย่างต่อเนื่องกันเป็นลูกโซ่ ทำให้ได้ DNA สายใหม่เพิ่มขึ้นเป็นล้านเท่า โดยหลักการของพีซีอาร์ก็เป็นการเลียนแบบจากกระบวนการ จำลองตัวเองของ DNA ในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตนั่นเอง

       เทคนิคพีซีอาร์นับเป็นวิธีการง่ายๆ ที่ทำให้เกิดการพัฒนาการศึกษาทางด้านพันธุศาสตร์อย่างมาก เลยทีเดียว โดยผู้ที่ค้นพบคือ แครี มุลลิส (Kary Mullis) ซึ่งเค้าได้รับรางวัล Nobel Prize สาขาเคมี ในปี ค.ศ. 1993 จากการค้นพบเทคนิคพีซีอาร์นี้ หากสนใจประวัติของเค้าก็เข้าที่เวบไซต์ต่อไปนี้ได้เลยค่ะ http://www.karymullis.com/

เราจะต้องอาศัยสิ่งใดบ้างจึงจะสามารถสร้าง DNA ได้ ?

การทำพีซีอาร์อาศัยสิ่งต่อไปนี้ในการทำปฏิกิริยา

         อย่างแรก...ที่ขาดไม่ได้คือชิ้นส่วนของ DNA ที่เราต้องการจำลองนั่นเองคะ เรียกว่า DNA แม่แบบ (DNA Template)ซึ่งข้อดีของเทคนิคพีซีอาร์นี้คือใช้ตัวอย่าง DNA ที่สกัดจากตัวอย่าง เช่น เลือด เนื้อเยื่อ เพียงเล็กน้อย (ประมาณ 5 ไมดครลิตร) ก็สามารถนำมาเพิ่มจำนวนได้มากมายแล้ว

         ส่วนต่อมา…ที่จำเป็นในการสังเคราะห์ DNA คือ เอนไซม์ DNA polymerase ซึ่งจะใช้ชนิดพิเศษ ที่สามารถทนความร้อนได้สูง นั่นคือ Taq polymerase โดยสกัดมาจากแบคทีเรีย (Thermus aquaticus) ที่สามารถทนความร้อนได้ดีและอาศัยในน้ำพุร้อน

ทำไมจึงต้องเลือกใช้เอนไซม์ที่สามารถทนความร้อนสูง ๆ ได้ด้วยนะ ?

         ไพรเมอร์ (DNA primer) เป็น DNA สายสั้น ๆ ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สม (complementary) กับ DNA แม่แบบ ซึ่งจะเข้าคู่กับด้าน 3′ ของ DNA แม่แบบ โดยไพรเมอร์ทำหน้าที่เป็นจุดเริ่มต้นในการ สังเคราะห์ DNA สายใหม่ ก่อนที่จะเริ่มทำพีซีอาร์ได้นั้น เราต้องทราบลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA  แม่แบบบริเวณช่วงปลายของส่วนที่เราต้องการเพิ่มจำนวนก่อน เพื่อนำมาสังเคราะห์ไพรเมอร์

         นิวคลีโอไทด์ (Deoxynucleotide triphosphates, dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด (A T C และ G) เพื่อที่จะ นำไปใช้ในการสังเคราะห์สาย DNAสารทั้งหมดนี้จะละลายอยุ่ในสารละลายบัฟเฟอร์ เพื่อ ควบคุมให้เกิดภาวะที่ เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา ภายในหลอดทดลองขนาดเล็ก (ปริมาตร 200-500 ไมโครลิตร)

            จากนั้นนำหลอดส่วนผสมไปใส่ในเครื่องเทอร์มอไซเคลอร์ (thermocycler หรือ PCR machine) ซึ่งสามารถควบคุมอุณหภูมิได้ตามขึ้นตอนที่ตั้งไว้

เครื่องเทอร์มอไซเคลอร์

ขั้นตอนปฏิกิริยา PCR มี 3 ขั้นตอน ดังนี้

         1. denaturing เป็นการทำให้ DNA เสื่อมสภาพ เพื่อที่จะแยกสาย DNA จากสภาพที่เป็นเกลียวคู่ (double helix) ให้เป็นสายเดี่ยว โดยใช้อุณหภูมิสูงประมาณ 95 องศาเซลเซียส เวลา 30 วินาที ดังนั้นเราจึง ต้องเลือกใช้เอนไซม์ DNA polymerase ที่สามารถทนความร้อนได้สูง เพื่อไม่ให้เอนไซม์เสื่อสภาพไปก่อน

         2 . annealing เป็นขั้นตอนที่ลดอุณหภูมิลงประมาณ 55 องศาเซลเซียส เวลา 20 วินาที เพื่อให้ ้ไพรเมอร์สามารถจับกับ DNA แม่แบบได้

         3. extension เป็นขั้นตอนการสังเคราะห์ DNA สายใหม่ โดยจะสังเคราะห์จากด้าน 5′ ของไพรเมอร์ ไปยังด้าน 3′ ไปเรื่อยๆ ตามลำดับนิวคลีโอไทด์บน DNA แม่แบบแต่ละสาย โดยอาศัยการทำงานของ Taq polymerase ที่อุณหภูมิประมาณ 72 องศาเซลเซียสเวลา 20 วินาที ซึ่งเป็นอุณหภูมิที่แบคทีเรียที่ใช้ในการ สกัดเอนไซม์เติบโต

         จากนั้นจะเริ่มขึ้นตอนแรกใหม่หมุนเวียนต่อกันไปหลายๆ รอบ โดยปฏิกิริยา PCR 25-40 รอบจะใช้ ้เวลาประมาณ 1.5 -5 ชั่วFดมง หลังจากทำปฏิกิริยาจะได้สาย DNA สายใหม่จำนวนมากที่ถูกกำหนดตามขนาด ของระยะห่างของไพรเมอร์ทั้งสองสายที่จับกับ DNA แม่แบบ จากนั้นนำผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ไปตรวจสอบด้วย agarose gel electrophoresis

ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ และ DNA ladder ซึ่งเป็นชิ้นส่วนของ DNA ที่ทราบขนาด

            ในปัจจุบันเทคนิคพีซีอาร์ใช้กันอย่างแพร่หลายทั้งในด้านการแพทย์ เช่น ใช้ในการตรวจสอบโรค ด้านพันธุวิศวกรรม ใช้ในการเพิ่มปริมาณยีนเพื่อที่จะนำมาศึกษาและการหาลำดับนิวคลีโอไทด์

เอกสารอ้างอิง

สถาบันส่งเสริมการสอนวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี. 2548. หนังสือเรียนสาระการเรียนรู้พื้นฐานและเพิ่มเติมชีววิทยา เล่ม 5 กลุ่ม

         สาระการเรียนรู้ วิทยาศาสตร์ ชั้นมัธยมศึกษาปีที่ 6 หลักสูตร การศึกษาขั้นพื้นฐาน พุทธศักราช 2544. 255 หน้า

ประดิษฐ์ พงศ์ทองคำ. 2543. พันธุศาสตร์. สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. กรุงเทพฯ. 398 หน้า

Leland H. Hartwell, et. al. 2000. Genetics From Genes to Genomes. The McGraw-Hill Companies,

         United State of Amarica. 820 p

Robert H. Tamarin. 2002. Principles of Genetics 7th. The McGraw-Hill Companies, United State of

         Amarica. 684 p

Polymerase Chain Reaction – Xeroxing DNA (1992). Online. (Available):

          http://www.accessexcellence.org/RC/AB/BC/PCR_Xeroxing_DNA.html (Retrieved

          25/07/07)

Polymerase chain reaction. Online. (Available): http://en.wikipedia.org/wiki/PCR  (Retrieved

          25/07/07)

1993 Nobel Prize in Chemistry (2004). Online. (Available): http://www.karymullis.com/ (Retrieved

          25/07/07)

 50,219 total views,  4 views today

ในการทำ PCR ภายในหลอดทดลองมีอะไรเป็นส่วนประกอบบ้าง

ขั้นตอนที่ใช้อุณหภูมิสูงที่สุดในการทำ PCR คือ ขั้นตอนใด

องค์ประกอบใดจำเป็นต่อการเกิดปฏิกิริยาในหลอดทดลองของเทคนิค PCR

ขั้นตอน denature ในการ PCR ทำเพื่อวัตถุประสงค์ในข้อใด